一、 總則與準備工作
 

　　細胞凍存是生物樣本庫、細胞治療及基礎研究中的關鍵環(huán)節(jié)，旨在長期保存活細胞的功能與活性。OriGen細胞凍存袋作為一種專為低溫儲存設計的高性能容器，其標準化的操作流程對保障細胞復蘇后的存活率、純度和安全性至關重要。本規(guī)范旨在提供一套從灌裝到長期儲存的完整、可重復的操作指南，所有步驟必須在符合相應生物安全等級的超凈工作臺或生物安全柜內，由經過培訓的人員執(zhí)行。操作前，操作者需穿戴好個人防護裝備，并確保工作區(qū)域清潔、有序，所有試劑與耗材均已準備就緒并通過質量檢查。
 

　　二、 材料與試劑準備
 

　　凍存袋：檢查OriGen凍存袋的外包裝是否完好、在有效期內。確認凍存袋型號與容量(如25mL、100mL)符合樣本量需求。觀察袋體、管路及端口有無肉眼可見的破損或污染。
 

　　細胞懸液：制備單細胞懸液，細胞活力與濃度需符合后續(xù)應用標準。通常，凍存前細胞活力應高于90%。
 

　　程序性冷凍保護劑：根據(jù)細胞類型選擇并預冷合適的凍存培養(yǎng)基(通常為基礎培養(yǎng)基，含10-20%的胎牛血清及規(guī)定濃度的二甲基亞砜或其它冷凍保護劑)。凍存培養(yǎng)基需提前配制，經0.22μm濾膜過濾除菌，并在2-8℃預冷，以減少對細胞的毒性。
 

　　輔助耗材與設備：無菌注射器(適當規(guī)格，如20mL、60mL)、無菌移液管、酒精棉片、止血鉗、熱合鉗、yong久性標記筆、條形碼打印機與標簽、樣本信息記錄表。預先準備程序降溫儀或異丙醇梯度降溫盒，并確認其處于正常工作狀態(tài)。確認液氮罐儲存空間充足，并有可靠的氣相液氮保存支架。
 

　　三、 灌裝與混合
 

　　凍存袋準備：在超凈工作臺內，撕開凍存袋的外包裝，取出凍存袋。輕柔擠壓袋體，檢查其密封性。將凍存袋平穩(wěn)放置于工作臺面，確保灌裝管路易于操作。
 

　　細胞與凍存液混合：
 

　　在預冷的離心管中，將預先計數(shù)、離心后的細胞沉淀與預冷的凍存培養(yǎng)基按既定比例(如1:1)緩慢、輕柔地重懸混合?；旌线^程應在冰上進行，以維持低溫環(huán)境。
 

　　重懸時應使用大口徑移液管輕柔吹打，確保形成均勻的單細胞懸液，避免產生氣泡。最終細胞濃度應符合凍存要求(例如，免疫細胞常為1-5×10^7 cells/mL)。
 

　　灌裝操作：
 

　　使用無菌注射器或通過管路接口，將混合均勻的細胞懸液緩慢注入凍存袋中。灌裝速度應平穩(wěn)，盡量減少對細胞的剪切力。
 

　　關鍵步驟：灌裝量不得超過凍存袋的標稱最大容量，必須預留足夠的頂部空間(通常建議灌裝量為總容量的50-60%)，以供液體在凍結時膨脹，防止袋體破裂。例如，100mL凍存袋灌裝量不宜超過60mL。
 

　　灌裝完成后，輕柔拍打或晃動凍存袋，使細胞在袋內分布均勻，避免細胞沉降導致局部濃度過高。
 

　　四、 排氣、密封與取樣
 

　　排氣：將凍存袋豎直懸掛，使液體因重力集中于袋體底部。從灌裝口相反方向，緩慢向上卷動袋體，將頂部氣體逐步驅趕至灌裝管路末端。此步驟需耐心操作，盡可能排除袋內空氣。殘留氣泡在凍存過程中可能因膨脹導致密封處薄弱或影響降溫均勻性。
 

　　熱合密封：
 

　　確認氣體基本排盡后，在靠近袋體的灌裝管路上，使用經過驗證的專用熱合鉗，在預定位置進行熱合封口。熱合前，確保該段管路內無液體。
 

　　熱合時，施加均勻壓力并保持規(guī)定時間，確保密封完整、牢固。熱合完成后，在第一個熱合點外側(靠近管路末端)進行二次熱合，作為冗余密封，提供雙重保障。
 

　　使用無菌剪刀，在兩次熱合點之間剪斷管路，分離凍存袋主體。
 

　　留樣與檢測：剪下的管路末端內可能殘留少量細胞懸液，可作為留樣，用于立即進行細胞計數(shù)、活力檢測(如臺盼藍染色)或無菌檢測，以記錄凍存前的細胞質量。
 

　　五、 標識與信息記錄
 

　　標識要求：在熱合密封后、程序降溫前，必須立即對凍存袋進行清晰、防凍的標識。
 

　　標識內容：至少應包含樣本編號、細胞類型/名稱、代次、凍存日期、操作者姓名或代號。推薦使用預先打印的條形碼或二維碼標簽，并與信息系統(tǒng)關聯(lián)。
 

　　貼附規(guī)范：將標識牢固貼附于凍存袋的指定標簽區(qū)域(通常為袋體上部)。確保標簽平整，信息清晰可讀，且粘貼材質能耐受液氮低溫，避免在低溫下脆化、脫落或字跡模糊。
 

　　信息登記：同步在樣本信息記錄表或電子數(shù)據(jù)庫中進行詳細登記，包括上述標識信息，以及細胞濃度、活力、凍存體積、凍存盒編號與在液氮罐內的預設位置等。
 

　　六、 程序降溫
 

　　降溫策略選擇：細胞凍存必須采用受控的程序性降溫，以最大限度減少冰晶形成對細胞的物理損傷和化學損傷。嚴禁將細胞凍存袋直接投入液氮或-80℃冰箱。
 

　　程序降溫儀法：
 

　　將標識好的凍存袋水平放置于程序降溫儀的冷凍室內，確保袋體平展，細胞分布均勻。
 

　　啟動預設的標準降溫程序。典型程序為：以-1℃/min的速率從室溫(或4℃)降溫至-40℃或-50℃，然后以-5℃至-10℃/min的速率快速降溫至-80℃以下。具體程序應根據(jù)細胞類型優(yōu)化。
 

　　程序運行期間，需監(jiān)控設備運行狀態(tài)，確保無中斷。
 

　　異丙醇梯度降溫盒法：
 

　　將凍存袋放入盒內，并加入適量異丙醇至規(guī)定刻度。
 

　　將整個盒子置于-80℃超低溫冰箱中。異丙醇能確保樣品以近似-1℃/min的速率緩慢降溫。
 

　　在-80℃冰箱中保存至少4小時，最好過夜，確保樣品核心溫度已降至-80℃以下。
 

　　七、 長期液氮儲存
 

　　轉移時機：經過程序降溫，樣品溫度穩(wěn)定低于-80℃后，應盡快轉移至長期儲存的液氮罐中，避免在中間溫度停留過久。
 

　　儲存方式：
 

　　必須采用氣相液氮儲存，即將凍存袋置于液氮液面之上的氣相空間，溫度約為-150℃至-196℃。嚴禁將凍存袋直接浸入液相液氮，以防因密封瑕疵導致液氮滲入袋內，在復蘇時急劇氣化引起爆炸風險。
 

　　將凍存袋放入專用的、帶有編號的凍存盒或凍存架中，再整體放入液氮罐的氣相儲存區(qū)。
 

　　位置管理與安全：記錄每個凍存袋在液氮罐中的精確位置(如罐號、提筒號、行、列)。定期檢查液氮罐的液位，確保液氮量始終維持在規(guī)定范圍內。液氮罐應放置在通風良好的區(qū)域，并配備氧濃度監(jiān)測報警裝置。